徠卡 DM2500 熒光顯微鏡細胞染色觀察

一、徠卡 DM2500 熒光顯微鏡核心配置與技術優勢

• 光源類型：

• 藍光通道（BP450-490，適合 FITC、GFP，發射光 515-550nm）；

• 綠光通道（BP510-550，適合 TRITC、Texas Red，發射光 590nm 長通）；

• 紫外通道（BP330-385，適合 DAPI、Hoechst，發射光 420nm 長通）。

• 標配 100W 汞燈（適合 DAPI、FITC、TRITC 等常規熒光染料），可選配 LED 固態光源（壽命長、穩定性高）。

• 濾光片組（Cube）：

• 物鏡兼容性：

• 高數值孔徑（NA）物鏡（如 Plan Apo 40×/0.95，油鏡 100×/1.3），減少熒光信號損失。

二、細胞染色樣本制備與熒光標記策略

（一）樣本固定與透化

1. 固定方法

• 醛類固定：4% 多聚甲醛（室溫 10-15min），保持細胞形態，適合膜蛋白標記；

• 甲醇 / 丙酮固定（-20℃，5min），增強膜通透性，適合胞內抗原（如細胞骨架）。

2. 透化處理

• 0.1% Triton X-100/PBS（室溫 5min），破壞細胞膜脂質雙分子層，便于抗體或染料進入胞內。

（二）熒光染色方案（按靶標分類）

三、DM2500 熒光觀察操作流程與參數優化

（一）顯微鏡啟動與光路調節

1. 光源預熱與濾光片切換

• 汞燈需預熱 10-15min 至穩定，避免頻繁開關（影響壽命）；

• 根據染料選擇對應濾光片組，通過轉盤切換（如觀察 DAPI 時插入 UV Cube）。

2. ** K?hler 照明調節 **

• 調節聚光鏡光闌（縮小至 1/2 視野），調中聚光鏡后擴大光闌，確保光斑均勻覆蓋視野。

（二）熒光觀察步驟

1. 低倍鏡定位與高倍鏡切換

• 先用明場（10× 物鏡）找到細胞區域，標記后切換至對應熒光通道；

• 切換高倍鏡（40×/100×）時，滴加鏡油（油鏡），緩慢調節細準焦螺旋至圖像清晰。

2. 曝光與信號采集

• 調節光源強度（通過 ND 濾光片，10%-50% 即可），避免強激發導致熒光淬滅；

• 相機曝光時間：DAPI 約 50-100ms，FITC 約 100-300ms，根據信號強弱微調（避免過曝產生偽影）。

（三）防淬滅與背景控制

• 封片優化：

• 用含抗淬滅劑的封片劑（如 Vectashield），蓋玻片四周用指甲油密封，減少熒光衰減；

• 背景抑制：

• 樣本洗滌：PBS 洗 3 次，每次 5min，去除未結合染料；

• 自發熒光排除：用陰性對照（未染色細胞）確定背景熒光水平。

四、熒光圖像采集與分析要點

1. 拍攝參數標準化

• 統一放大倍數、曝光時間、增益（Gain），便于組間對比；

• 多通道成像時，采用 “順序掃描"（先拍短波長再拍長波長），避免串色（如 DAPI 激發光干擾 FITC 信號）。

2. 定量分析指標

• 熒光強度：用 ImageJ 軟件測量平均熒光密度（Integrated Density），排除背景值；

• 共定位分析：通過 Pearson 系數（0-1）量化兩種熒光信號的重疊程度；

• 細胞計數：結合 DAPI 核染色，自動計數視野內細胞數量（需設置合適閾值）。

3. 動態觀察（活細胞）

• 配置加熱臺（37℃）和 CO?培養箱，維持細胞活性；

• 采用間隔拍攝（如每 5min 一次），記錄熒光蛋白（如 GFP）的動態分布。

五、常見問題與解決方案

六、延伸技術：DM2500 熒光顯微鏡的進階應用

• FISH（熒光原位雜交）：

• 用于基因定位（如染色體熒光標記），需搭配紫外通道觀察探針信號；

• 免疫熒光共染色：

• 結合兩種以上抗體（如 α-tubulin-FITC + γ-H2AX-TRITC），研究 DNA 損傷與微管關系；

• 光漂白恢復（FRAP）：

• 通過高強度激光漂白局部熒光，利用 DM2500 的高靈敏度相機記錄熒光恢復速率，分析蛋白流動性。

七、安全操作與設備維護

• 光源防護：

• 汞燈開啟時避免直視光源，佩戴紫外防護眼鏡；

• 染料安全：

• 熒光染料（如 DAPI、PI）具潛在毒性，操作時戴手套，廢棄物按生物危害處理；

• 日常維護：

• 每周用無塵布清潔載物臺和物鏡，每月檢查濾光片組是否有灰塵（影響光透過率）。